研究背景

生物体内的胶原蛋白是细胞外基质的一种结构蛋白质，广泛地存在于动物骨、软骨、筋腱、皮肤和一些结缔组织中，约占哺乳动物自身所含蛋白质总量的25%～35%。皮肤中胶原蛋白主要分布于真皮层，含量约为70%，主要分为I（85%）、III和V型胶原蛋白。胶原蛋白在细胞间形成了一种网状结构，将透明质酸、水分等物质锁住，为皮肤提供弹性，是皮肤营养、代谢以及生长修复必不可少的一种物质。不过从25岁起，人体内胶原蛋白每年会以1.5%的速率开始流失，45岁时人体流失胶原蛋白量约为30%。胶原蛋白流失会使皮肤变得干燥、粗糙，出现松弛、皱纹、色斑等现象。为了延缓衰老，改善皮肤质量，人们开始探究口服胶原蛋白的美容效果。

胶原蛋白的生物利用率比较低，在人体很难被直接吸收。不过利用蛋白酶将其酶解为胶原肽形式，可以大幅度提高其吸收利用率。对于胶原肽食品的营养价值，社会上还有疑虑的声音，认为胶原蛋白并没有美容功效，摄入过多可能增加肾脏负担，其营养价值还不如鸡蛋。为此，我们研究团队从剂量、产品分子量、制备方式等不同角度对口服胶原肽的美容效果进行了多年的研究，并从胶原肽中分离鉴定出了活性成分，探究了其分子作用机制。

口服胶原肽有没有效果呢？

我们选取了两种皮肤老化模型进行试验：光老化和自然老化。光老化属于一种外源性老化，所用的方法是用紫外线定期照射小鼠的皮肤，长时间照射会出现皮肤干燥、粗糙、细微皱纹等现象；自然老化是一种内源性老化，主要受年龄、遗传因素、营养和生活习惯影响，随着年龄增长会出现较严重的皮肤松弛、皱纹、老人斑等现象。

下一步采用光老化模型研究不同剂量对小鼠光老化的影响。结果表明，随着鲢鱼皮胶原肽剂量的增加，小鼠的皮肤修复能力逐渐的增强，高剂量组（HDCP）的小鼠几乎没有发生光斑和皮肤粗糙的现象（见图1）。

图1 不同剂量的胶原肽对小鼠光老化皮肤表观的影响（6 W）

注：N，正常组；M，模型组；HDCP，高剂量胶原肽组；MDCP，中剂量胶原肽组；LDCP，低剂量胶原肽组；CH，酪蛋白对照组。

接下来研究的是胶原肽分子量大小对小鼠光老化的影响。我们选取了三种样品：未水解的胶原蛋白（明胶），大分子胶原肽（1000-3000 Da），小分子胶原肽（200-1000 Da）。结果显示小分子胶原肽的抗老化效果最好的，证明了活性寡肽比多肽具有更高的生物利用度和生理活性（见图2）。

图2  不同分子量胶原肽对小鼠光老化皮肤表观的影响

注：N，正常组；M，模型组；Gelatin，明胶组；HMCH，大分子胶原肽组；LMCH，小分子胶原肽组；CAP，酪蛋白肽对照组。A，皮肤重量；B，皮肤含水量；C，羟脯氨酸含量；D，透明质酸含量。

胶原肽制备方法对皮肤修复效果也有显著影响。我们分别用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶将胶原蛋白酶解到相似分子量，得到高、中、低抗氧化胶原肽（HCP、MCP、LCP），然后利用小鼠光老化模型进行研究。结果发现，三种制备方法的胶原肽对小鼠的皮肤修复作用有一定差异，高抗氧化胶原肽的效果最好，说明胶原肽的抗氧化活性与皮肤的修复效果之间具有一定的相关性。另外和对照组比较，可以看出茶多酚和酪蛋白的延缓皮肤衰老能力远不如胶原蛋白（见图3）。

图3  不同胶原肽制备方法对小鼠光老化皮肤表观的影响

注：N，正常组；M，模型组；HCP，MCP，LCP分别为高、中、低抗氧化胶原肽组；TP，茶多酚对照组；CP，酪蛋白肽对照组；0，1，2分别代表建模后第0，1，2周

上述研究表明，中高剂量、低分子量、抗氧化性强的胶原肽对紫外辐射引起的皮肤光老化有很好的修复效果。从营养的角度，补充充足的胶原蛋白氨基酸是否可以达到同样的效果？我们分别用碱性蛋白酶和胶原酶将牛骨中的明胶酶解成两种胶原肽（ACP和CCP），与水解产物氨基酸和脯氨酸组（CTH和MP）进行对照，利用13月龄的小鼠（相当于45岁的人类）自然老化模型进行试验。结果表明，8周后，ACP、CCP、CTH、MP组的小鼠羟脯氨酸含量明显提升，皮肤松弛度均有所改善，但是水分和透明质酸含量没有显著变化（见图4）。通过对小鼠皮肤组织HE染色，可以看出服用胶原肽可改善小鼠皮肤真皮结构以及胶原纤维的含量和形态，保持细胞器的数量，缓解皮肤老化（见图5）。

图4 小鼠皮肤成分的变化（n=10）

注：YC，年轻小鼠（2月龄）正常组；M，模型组；MCTH，氨基酸对照组；MP，脯氨酸对照组；HACP，MACP，LACP分别为高、中、低剂量的ACP胶原肽组；MCCP，中等剂量的CCP胶原肽组

图5  小鼠皮肤组织HE染色图

胶原肽的作用机制和活性成分

通过动物实验确定了胶原肽抗皮肤衰老的效果，下一步就需要对它的活性成分和作用机制进行探究。我们以皮肤成纤维细胞（ESF）作为细胞模型，以胶原肽代谢物作为研究对象，模拟胶原肽消化吸收后至皮肤靶细胞发挥作用的过程。

我们还是选取了碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分别将鲢鱼皮胶原肽酶解到相似分子量，得到HCP、MCP、LCP进行试验。图6 是小鼠口服2.4 g/kg HCP后血清中的代谢动力学曲线，可以看到，游离和以肽形式的羟脯氨酸（Hyp）在口服后2小时达到高峰；随着口服剂量的增加，血清中的氨基酸和肽含量也在增加。

图6 血清中Hyp 浓度-时间/剂量曲线

注：A: 游离Hyp含量; B: 肽形式Hyp含量 C: 游离Hyp含量; D 含Hyp的肽含量。

取含肽血清，在长波紫外线(UVA)辐照下培养ESF细胞，再利用酶联免疫吸附检测技术对光损伤ESF细胞的I型胶原和透明质酸含量进行计算。结果显示，不同制备方法的胶原肽对细胞I型胶原的含量影响显著，HCP效果最好，LCP几乎不影响细胞I型胶原含量；三种胶原肽对透明质酸含量的影响没有差异（见图7）。

图7 在10%含肽血清中培养的光损伤ESF细胞I型胶原和透明质酸含量

注：N，正常组；M，模型组；CS，空白血清组；HCPS，MCPS，LACPS分别为高、中、低抗氧化胶原肽组；AA，氨基酸对照组；TP，茶多酚对照组。

我们将含肽血清进行分离得到胶原肽，用同样的方法培养光损伤EFS细胞，结果表明高活性胶原肽也能够维持细胞的正常形态，提高细胞I型胶原和透明质酸的含量；茶多酚和氨基酸没有这个功效（见图8）。

图8 在10%胶原肽中培养的光损伤ESF细胞I型胶原和透明质酸含量

注：N，正常组；M，模型组；SC，空白血清组；SHCP，MCP，LACP分别为从血清中分离出来的高、中、低抗氧化胶原肽组；AA，氨基酸对照组；TP，茶多酚对照组。

根据光老化机制，紫外照射会产生大量的活性氧族（reactive oxygen species, ROS），ROS攻击体内抗氧化酶促系统，导致抗氧化酶的活性下降；通过激活AP-1，诱导MMPs表达增多，导致I型胶原降解；同时降低TGF-β/Smad水平，下调I型胶原合成通路。我们以信号通路的关键指标进行测定，探究胶原肽对于ESF细胞产生的活性氧的清除作用。结果显示，高活性胶原肽组清除效果很明显，茶多酚也有一定的清除作用（见图9）。

图9  血清胶原肽对光损伤细胞产生的活性氧（ROS）的清除作用

下一步研究的是胶原肽对于抗氧化酶促系统的作用。模型组由于紫外照射，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性迅速下降，丙二醛（MDA）迅速上升，用胶原肽培养后细胞酶活明显提升，高活性胶原肽组效果最好，茶多酚组的酶活也有显著的提升（见图10）。

图10  血清胶原肽对光损伤皮肤细胞抗氧化酶系的影响

我们通过蛋白质印迹分析技术，检测用不同胶原肽培养的ESP细胞AP-1、MMPs表达水平和TGF-β/Smad信号传导情况，探究胶原肽对胶原蛋白合成和降解通路的影响。结果显示高活性胶原肽可以显著提升AP-1、MMPs表达水平，促进胶原蛋白合成，并有效抑制AP-1、MMPs表达，减少胶原蛋白的降解；茶多酚对胶原蛋白合成和降解通路没有影响（见图11）。

图11 胶原肽对胶原蛋白合成和降解通路的影响

在上述研究的基础上，我们对血清胶原肽中活性成分进行了分离鉴定。口服胶原肽之后，小鼠血液中出现了8条胶原肽段。通过进一步研究，发现1条二肽能够促进皮肤细胞的增殖，且提高细胞中透明质酸的含量；还有2条寡肽能够激活TGF-β/Smad 信号通路，从而促进胶原蛋白的合成；其中一条还能够同时能够降低 AP-1的亚基c-Fos的表达，从而抑制胶原蛋白的降解。